因为机缘巧合，土方岁三结识了尚在开设道场的近藤勇，于安政六年（1859年）3月29日正式加入天然理心流。四年之后，土方岁三跟随近藤勇等人参加了护卫将军德川家茂的浪士组招募考试，并成为浪士组的一员。

文久三年（1863年）八月十八日，会津藩会同萨摩藩将尊皇攘夷派的长州藩赶出京都，史称“八一八之变”。本来声名低微的浪士组在政变中崭露头角，被赐名为新选组。

以近藤勇为首的势力排挤了新选组中的水户天狗党势力，近藤勇坐上了局长的宝座，而土方岁三被任命为副长。土方岁三的排名虽在近藤勇之下，但他长于谋略，是新选组的实际支配者。

庆应四年（1868年），鸟羽伏见的枪声点燃了戊辰战争战火，新政府和幕府进入对抗状态。

近藤勇因伤在身，委托土方岁三带领新选组参战，但号称精悍的新选组在新政府军的西式枪炮面前依旧难逃一败涂地境地。